邻-甲联苯胺法测定血浆游离血红蛋白的基质效应及消除方法

屠湧涛;刘清琳;徐敏敏;王莺

【摘 要】目的：研究邻-甲联苯胺法（经典方法）测定血浆游离血红蛋白（Hb）的基质效应及消除方法。方法以用生理盐水1000倍稀释的 Hb 储存液（浓度为103.1 g/L）作为标准液，将此 Hb 标准液再用无 Hb 血浆分别稀释500、1000、2000、4000倍（游离 Hb 理论浓度分别为206.20、103.10、51.55、25.78 mg/L），然后用经典方法测定游离 Hb 浓度，比较与理论值的差异。将 Hb 储存液分别用生理盐水（经典方法）、无 Hb 血浆（消除方法1）、混合血浆（消除方法2）1000倍稀释作为标准液。经典方法和消除方法1的计算公式为血浆游离 Hb（mg/L）=测定管吸光度（A）值×标准液浓度÷标准管 A 值；消除方法2的计算公式为血浆游离 Hb（mg/L）=测定管 A 值×标准液浓度÷（标准管 A 值×混合血浆 A 值）；消除方法3操作同经典方法，计算公式为血浆游离 Hb（mg/L）=测定管 A 值×标准液浓度×2.35÷标准管 A 值。测定40份标本，比较各消除方法的结果。在血浆中分别加入206.20、103.10、51.55 mg/L Hb，测定各消除方法的回收率。分别取6.25、12.50、25.00、50.00μg/L 维生素 C 溶液4.5 mL，各加1.031 g/L Hb 标准液0.5 mL，用经典方法测定回收率。结果采用无 Hb 血浆500、1000、2000、4000倍稀释的 Hb 标准液的游离 Hb 测定结果分别为87.85、43.16、21.90、10.99 mg/L。40份标本采用经典方法、消除方法1、消除方法2、消除方法3测定的游离 Hb 浓度分别为（7.99±4.90）、

（18.61±11.42）、（19.18±11.77）、（18.77±11.52）mg/L；消除方法1、消除方法2、消除方法3的结果均高于经典方法（P 均<0.01），但3种消除方法之间差异均无统计学意义（P 均>0.05）。经典方法、消除方法1、消除方法2、消除方法3的平均回收率分别为42.54%、98.33%、100.98%、97.56%。采用经

典方法检测Hb 在6.25、12.50、25.00、50.00μg/L 维生素 C 溶液中的回收率分别为98.57%、98.17%、97.17%、95.16%。结论邻-甲联苯胺法测定血浆游离 Hb 存在基质效应，3种消除方法均可消除基质效应影响。%Objective To study the matrix effect of o-methyl benzidine method(classic method)in determining plasma free hemoglobin(Hb)and the eliminating methods. Methods Hb storage solution diluted 1 000 times by normal

saline(concentration was 103.1g/L)was used as standard,while the standard diluted by Hb-free plasma 500,1 000,2 000 and 4 000 times(theoretical concentrations were 206.20,103.10,51.55 and 25.78 mg/L)was determined by classic method for plasma free Hb. The results were compared with theoretical values. Hb storage solution diluted 1 000 times by normal saline(classic method),Hb-free plasma(eliminating method 1)and mixed plasma(eliminating method 2)was used as standard. The equation of classic method and eliminating method 1 was plasma free Hb(mg/L)=test tube absorbance(A)× concentration of standard ÷ standard tube A. The equation of eliminating method 2 was plasma free Hb(mg/L)= test tube A×concentration of standard ÷(standard tube A× mixed plasma A). The equation of eliminating method 3 was plasma free Hb(mg/L)= test tube A× concentration of standard ×2.35÷standard tube A. A total of 40 specimens were determined,and the results of different eliminating methods were compared. Hb of 206.20,103.10 and 51.55 mg/L were added into plasma,and the recovery rate of each method was determined. Adding 0.5 mL of 1.031 g/L standard,in 4.5 mL of vitamin C solution of 6.25,12.50, 25.00 and 50.00 μg/L,the recovery rate was determined by classic method.

Results The theoretical values of plasma free Hb were 87.85,43.16,21.90 and 10.99 mg/L for standard diluted by Hb-free plasma 500,1 000,2 000 and 4 000 times. As to 40 specimens,plasma free Hb concentrations of classic method,eliminating method 1,eliminating method 2 and eliminating method 3

were(7.99±4.90),(18.61±11.42),(19.18±11.77)and(18.77±11.52)mg/L,the results of eliminating method 1,eliminating method 2 and eliminating method 3 were higher than that of classic method(P<0.01), and there was no statistical significance among the 3 eliminating methods(P>0.05). The average recovery rates of classic method,eliminating method 1 ,eliminating method 2 and eliminating method 3 were 42.54%,98.33%,100.98%and 97.56%. The recovery rates of vitamin C solution of 6.25,12.50,25.00 and 50.00 μg/L were 98.57%,98.17%, 97.17% and 95.16%. Conclusions There is matrix effect of o-methyl benzidine method in determining plasma free Hb, and the 3 eliminating methods are effective. 【期刊名称】《检验医学》 【年(卷),期】2016(031)004 【总页数】4页(P282-285)

【关键词】游离血红蛋白;基质效应;邻-甲联苯胺法 【作 者】屠湧涛;刘清琳;徐敏敏;王莺

【作者单位】绍兴第二医院检验中心，浙江 绍兴 312000;温州医科大学，浙江 温州 325035;绍兴第二医院检验中心，浙江 绍兴 312000;绍兴第二医院检验中心，浙江 绍兴 312000 【正文语种】中 文 【中图分类】R446.1

血浆游离血红蛋白（hemoglobin，Hb）测定的经典方法是邻-甲联苯胺法［1］。一些文献报道的替代方法也是与该法进行比较［2-5］。我们发现邻-甲联苯胺法测定血浆游离Hb存在基质效应：将标准储存液用生理盐水稀释与用血浆稀释，其结果有明显差异。目前尚无文献报道邻-甲联苯胺法测定血浆游离Hb存在基质效应。为此，我们对基质效应的大小及消除方法作了一些探讨。 一、仪器与试剂

721型分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。氰化高铁Hb标准液（批号20130617，天津市现代高科技研究院中山研究所）。氰化高铁Hb试剂（批号20140402151，上海荣盛生物药业有限公司）。10%冰乙酸。1 g/l过氧化氢。维生素C注射液（规格2 ml：0.5 g，浙江瑞新药业股份有限公司）。2 g/l邻-甲联苯胺：准确称取2 g邻-甲联苯胺，加冰乙酸600 ml，溶解后加去离子水至1 000 ml。Hb标准液：按文献［1］制备Hb储存液并定值（浓度为103.1 g/l），使用时1 000倍稀释。无Hb血浆：选取绍兴第二医院门诊和住院患者枸橼酸盐抗凝的凝血功能测定标本，收集用经典方法测定血浆游离Hb浓度为0 mg/l的血浆。另收集无溶血、 无黄疸、无脂浊的枸橼酸盐抗凝混合血浆、乙二胺四乙酸二钾（ethylene diamine tetraacetic acid-K2，EDta-K2）抗凝混合血浆、肝素抗凝混合血浆、混合血清。 二、样本

从绍兴第二医院患者枸橼酸盐抗凝的凝血功能测定标本中选取40份无明显溶血样本。

三、血浆游离Hb测定

采用邻-甲联苯胺法（经典方法）测定血浆游离Hb，操作步骤参照文献［1］：以用生理盐水1 000倍稀释的Hb储存液作为标准液，测定管加待测样本20 μl，标准管加标准液20 μl，测定管、标准管、空白管各加2 g/l邻-甲联苯胺1 ml和1 g/l过氧化氢1 ml，混匀后室温放置10 min，加10%冰乙酸10 ml，435 nm波长比色，以空白管调零，读取各管吸光度（A）值。结果计算公式：血浆游离Hb（mg/l）=测定管A值×标准液浓度÷标准管A值。 四、基质效应的影响

分别用无Hb血浆500、1 000、2 000、4 000倍稀释Hb储存液，理论浓度分别为206.20、103.10、51.55、25.78 mg/l，采用经典方法分别测定其Hb浓度。 五、基质效应的消除方法

40份枸橼酸盐抗凝样本采用经典方法和以下3种消除方法测定并计算结果。 1.消除方法1 以用无Hb血浆1 000倍稀释的Hb储存液作为标准液，操作步骤及结果计算同经典方法。

2.消除方法2 以用无溶血、无黄疸、无脂浊的枸橼酸盐抗凝混合血浆1 000倍稀释的Hb储存液作为标准液。操作步骤如下：测定管加待测样本20 μl，标准管加此标准液20 μl，对照管加稀释标准液的混合血浆20 μl，其余操作同经典方法。计算公式：血浆游离Hb（mg/l）=测定管A值×标准液浓度÷（标准管A值-对照管A值）

3.消除方法3 操作步骤同经典方法。计算公式：血浆游离Hb浓度=测定管A值×标准液浓度×2.35÷标准管A值。公式中2.35为常数。 六、回收试验

分别采用生理盐水50、100、200倍稀释Hb储存液，Hb理论浓度分别为2.062、1.031、0.516 g/l。每一浓度取0.5 ml，加枸橼酸盐抗凝混合血浆4.5 ml作为试验样本，以枸橼酸盐抗凝混合血浆4.5 ml加生理盐水0.5 ml作为基础样本，分别用经典方法和3种消除方法测定，每个样本重复测定3次，取均值（x ），计算回收率。用于回收试验的枸橼酸盐抗凝混合血浆和消除方法2稀释Hb储存液的枸橼酸盐抗凝混合血浆为非同一份血浆。同样，采用经典方法测定EDta-K2抗凝混合血浆、肝素抗凝混合血浆、混合血清回收率。 七、维生素C的干扰

取生理盐水稀释的Hb浓度为1.031 g/l的Hb标准液0.5 ml，分别加入生理盐水4.5 ml和用生理盐水稀释的6.25、12.5、25.00、50.00 μg/l维生素C溶液各4.5 ml。按经典方法测定游离Hb浓度。每个浓度重复测定3次，计算x。 八、统计学方法

采用sPss 13.0软件进行统计分析。计算x、标准差（s）和相关系数（r）。所有数据均呈正态分布，采用±s表示。不同方法的结果比较采用配对资料t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

一、经典方法测定无Hb血浆稀释Hb储存液的结果

采用无Hb血浆500、1 000、2 000、4 000倍稀释的Hb标准液的理论值分别为206.20、103.10、51.55、25.78 mg/l，其邻-甲联苯胺法（经典方法）测定结果分别为87.85、43.16、21.90、10.99 mg/l。

二、经典方法及3种消除方法测定40份枸橼酸盐抗凝样本Hb浓度的结果 采用经典方法及3种消除方法测定40份枸橼酸盐抗凝样本Hb浓度，结果分别为（7.99±4.9）、（18.61±11.42）、（19.18±11.77）、（18.77±11.52）mg/l；消除方法1、消除方法2、消除方法3的结果均高于经典方法（t值分别为10.305、10.307、10.308，P均＜0.01），但3种消除方法之间结果差异均无统计学意义

（t值分别为-0.221、-0.063，P均＞0.05）。见表1。 三、回收试验

经典方法测定枸橼酸盐抗凝、EDta-K2抗凝和肝素抗凝混合血浆及混合血清的平均回收率见表1。3种不同抗凝剂抗凝混合血浆的总平均回收率是42.57%。3种消除方法测定枸橼酸盐抗凝血浆的平均回收率分别为98.33%、100.98%、97.5%。见表2。

四、维生素C的干扰

在Hb浓度为1.031 g/l的样本中分别加入5.63、11.25、22.5、45.0 μg/l维生素C，采用经典方法检测Hb，其回收率分别为98.57%、98.17%、97.17%、95.16%。

以用生理盐水1 000稀释的Hb储存液作为标准液，然后再用无Hb枸橼酸盐抗凝血浆稀释此标准液，其实测浓度明显低于理论浓度；采用经典方法测定3种不同抗凝剂抗凝混合血浆的回收率也很低（见表1）；分别用生理盐水和无Hb枸橼酸盐抗凝血浆稀释Hb储存液作为标准液，然后用经典方法测定40份枸橼酸盐抗凝样本，经典方法和消除方法1之间差异有统计学意义（P＜0.01）。由此可以确定采用经典方法测定血浆游离Hb存在基质效应。

邻-甲联苯胺法测定血浆游离Hb产生基质效应的原因不明，推测血浆中的还原性物质可能是引起基质效应的原因之一。因邻-甲联苯胺法测定血浆游离Hb的原理是基于Hb中亚铁血红素有类似过氧化物酶的作用，在过氧化氢的参与下使无色的邻-甲联苯胺脱氢而显蓝色，属于氧化还原反应。维生素C干扰试验显示随着维生素C浓度的增高，回收率逐渐下降，提示还原性物质有负干扰，与魏寿忠等［3］的报道一致。正常人血清维生素C浓度为（6.43±4.16）μg/l［6］，虽然对回收率影响不大，但血浆中有许多还原性物质，多种还原性物质共同作用可能会产生明显影响。不同抗凝剂抗凝血浆的回收率与血清相近，提示抗凝剂无影响。

消除基质效应的方法是保持标准液和样本基质相同，消除方法1最好，但无Hb血浆的来源非常困难。消除方法2用无明显溶血的血浆稀释Hb储存液，操作中增加对照管，通过减去对照管A值，消除了该血浆本身所含的游离Hb的影响，其原理类似回收试验。消除方法3是根据基质效应导致结果降低了约2.35倍，将经典方法测定结果乘以2.35进行修正。因存在基质效应，超过线性范围的样本不能用生理盐水进行稀释，需用血浆进行稀释。如没有无Hb血浆，可用已知Hb浓度的血浆稀释，按公式修正：血浆游离Hb浓度=标本稀释后Hb浓度×稀释倍数×稀释血浆Hb浓度×（稀释倍数-1）。

血浆游离Hb测定是判断血管内溶血的指标。邻-甲联苯胺法测定血浆游离Hb的参考区间是＜40 mg/l［1］，这是用生理盐水稀释Hb储存液作为标准液得出的参考区间。因存在基质效应，故用消除方法测定血浆游离Hb时，其参考区间也要更改。 参考文献

［1］叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.3版.南京：东南大学出版社，2006：1.

［2］杨茂，邓晓琴.微板速率法测定血浆游离血红蛋白［J］.检验医学，2005，20（1）：88.

［3］魏寿忠，肖小慧，许冰峰.“a、B液法”测定血浆游离血红蛋白的探讨［J］.中国输血杂志，2005，18 （6）：491-492.

［4］徐树良，顾美玲.用ElIsa试剂盒的剩余a、B液作游离Hb测定［J］.临床输血与检验，2002，4 （3）：29-30.

［5］陈会海，郝万鹏.用HBHBa作色原测定血浆游离血红蛋白［J］.现代检验医学杂志，2002，17（2）：39-40.

［6］张晔，黎明新，王庆山.健康体检者血清维生素C浓度的实验分析［J］.中国冶金工业医学杂志，2007，24（5）：617-618.