一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 104367591 A (43)申请公布日(43)申请公布日 2015.02.25

(21)申请号 201410553174.0(22)申请日 2014.10.17

(71)申请人同路生物制药有限公司

地址230088 安徽省合肥市高新区燕子河路

376号(72)发明人胡辉恒 邓坤 董海军

(74)专利代理机构北京双收知识产权代理有限

公司 11241

代理人王菊珍(51)Int.Cl.

A61K 39/395(2006.01)

A61K 35/16(2015.01)A61K 47/34(2006.01)A61K 47/24(2006.01)A61K 38/38(2006.01)

权利要求书1页 说明书8页 附图1页

(54)发明名称

一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法(57)摘要

本发明公开了一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，包括如下步骤：(1)混合血浆；(2)加入CaCl2溶液搅拌后使用滤芯过滤澄清，得到过滤液；(3)加入吐温-80和磷酸三丁酯混合液，使得过滤液中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为(1±0.3)％和(0.3±0.1)％，保持反应液的温度在24±2℃，恒温4-6小时；(4)加入植物油，使得最终植物油的体积百分比为(5±2)％，降低反应液温度至16±2℃；(5)搅拌、静置；(6)抽提，弃除油相，得到的液相。本发明的方法极大提高原料血浆的安全性，降低二次污染的几率。 C N 1 0 4 3 6 7 5 9 1 A CN 104367591 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)将多人份血浆在常温下混合；(2)混合后的血浆精确计量体积，温度控制在24±2℃，加入CaCl2溶液使得混合后的血浆中最终CaCl2为(2±0.5)mmol/L，搅拌10分钟后使用孔径1μm的滤芯过滤澄清，得到过滤液；

(3)根据过滤液的体积量，加入30％的吐温-80(tween-80)和磷酸三丁酯(TNBP)混合液，使得过滤液中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为(1±0.3)％和(0.3±0.1)％，保持混合液的温度，控制在24±2℃，恒温4-6小时；

(4)恒温结束后，根据混合液体积，加入药用级的植物油，使得最终植物油的体积百分比为(5±2)％，降低反应液温度至16±2℃；

(5)快速搅拌15分钟，静止放置30分钟，使得油液相完全分层，得到混合液；(6)使用隔离泵从混合液底部进行抽提，弃除油相，得到的液相作为血液制品的原料进行人血白蛋白及静注人免疫球蛋白制品的制备。

2.根据权利要求1所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在于：所述混合后的血浆中最终CaCl2为2mmol/L。

3.根据权利要求2所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在于：所述过滤液中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为1％和0.3％。

4.根据权利要求3所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在于：所述植物油的体积百分比为5％。

5.根据权利要求4所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在于：所述血液制品的原料中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ均不低于0.7IU/ml。

6.根据权利要求5所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其特征在于：采用所述液相作为血液制品的原料制备得到的人血白蛋白及静注人免疫球蛋白制品中，tween-80残留量为不高于100ug/ml，TNBP残留量为不高于10ug/ml。

2

CN 104367591 A

说 明 书

1/8页

一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法

技术领域

本发明涉及一种病毒灭活处理的方法，特别是涉及一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法。

[0001]

背景技术

血液制品是一门新兴的生物医药行业，它的起始原料单一，为多人份健康人血浆

混合而成，在我国原料血浆的采集国家有非常严格的管理规定，要求对每一份采集的血浆必须进行多种病毒筛查检测，合格后方能作为原料进行生产。但是人类对于很多病毒的未知性和检测手段的第一，加上病毒检测方法本身的局限性，因此不能完全保证原料的绝对安全。国家食品药品监督管理局在2002年出台的[血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则]规定：为了提高血液制品安全性，生产工艺要具有一定的去除/灭活部分病毒能力，生产过程中应有特定的去除/灭活病毒方法，且生产过程中应有特定的能去除/灭活脂包膜和非脂包膜病毒的方法，可采用一种或多种方法联合去除/灭活病毒。[0003] 人类已知的通过人血液进行传播的病毒一般有三类，即脂包膜病毒(如乙肝病毒HBV)、非脂包膜病毒(如甲肝病毒HAV)和细小病毒(如B19)，目前国内生产企业生产的人血白蛋白等主要血液制品，多采用的是半成品后病毒处理且多是采用一次病毒灭活处理工艺，如巴斯德法(60℃，72小时处理)和低pH法(pH 4.0，21天放置处理)。因此如果对原料血浆直接进行病毒处理，将使得血液制品二次污染的几率大大降低，同时结合对半成品进行后病毒处理方式，将极大的提高血液制品应用安全性。

[0002]

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种极大提高原料血浆的安全性，降低二次污染的几率，同时结合现有产品原有的病毒灭活工艺(如巴斯德法和低pH法)，能极大的保障血液制品病毒安全性的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法。[0005] 一种对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，包括如下步骤：[0006] (1)将多人份血浆在常温下混合；[0007] (2)混合后的血浆精确计量体积，温度控制在24±2℃，加入CaCl2溶液使得混合后的血浆中最终CaCl2为(2±0.5)mmol/L，搅拌10分钟后使用孔径1μm的滤芯过滤澄清，得到过滤液；

[0008] (3)根据过滤液的体积量，加入30％的吐温-80(tween-80)和磷酸三丁酯(TNBP)混合液，使得过滤液中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为(1±0.3)％和(0.3±0.1)％，保持混合液的温度，控制在24±2℃，恒温4-6小时；[0009] (4)恒温结束后，根据混合液体积，加入药用级的植物油，使得最终植物油的体积百分比为(5±2)％，降低反应液温度至16±2℃；(5)快速搅拌15分钟，静止放置30分钟，使得油液相完全分层，得到混合液；[0011] (6)使用隔离泵从混合液底部进行抽提，弃除油相，得到的液相作为血液制品的原

[0010]

3

CN 104367591 A

说 明 书

2/8页

料进行人血白蛋白及静注人免疫球蛋白制品的制备。

[0012] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中所述混合后的血浆中最终CaCl2为2mmol/L。

[0013] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中所述过滤液中tween-80和TNBP的最终体积百分比分别为1％和0.3％，

[0014] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中所述植物油的体积百分比为5％。

[0015] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中所述血液制品的原料中凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ均不低于0.7IU/ml。

[0016] 本发明所述的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法，其中采用所述液相作为血液制品的原料制备得到的人血白蛋白及静注人免疫球蛋白制品中，tween-80残留量为不高于100ug/ml，TNBP残留量为不高于10ug/ml。

[0017] 本发明对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法与现有技术不同之处在于：

[0018] 血液制品是一种采用多人份健康人血浆或经特异性免疫的人血浆，混合后经低温乙醇或其他批准的工艺进行分级分离、提纯等技术制成的蛋白组分，用于治疗和被动免疫防治。作为新兴行业，因采用的是多人份混合血浆作为起始原料，虽然采用多种检测手段去最大限度避免病毒的污染，但因检测本身存在误差和检测手段的以及存在未知病毒等因素，所以血液制剂的使用存在被感染的风险，因此国家也强制要求各生产企业在生产工艺的应用病毒灭活处理方式已降低风险。

[0019] 本发明涉及一种对原料混合血浆进行病毒灭活处理的方法，其目的是为了提供一种成本低、操作简便的病毒灭活处理方式，从源头上把控，极大的降低药品病毒感染风险，同时使用该种病毒灭活后的血浆，仍能保持各种蛋白、因子及酶的活性。本发明包括：血浆合并后，加入保护剂和病毒灭活剂，经病毒灭活处理后，去除灭活剂，得到符合《中华人民共和国药典》2010年版三部规定的原料血浆。

[0020] 本发明对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法采用有机溶剂和去污剂联合应用，能有效去除脂包膜病毒，该病毒处理方式使用方便，简单易操作，采用有机溶剂和去污剂对原料混合血浆进行的初步病毒灭活处理，不仅降低血液制品二次污染的几率，同时能有效保持各种蛋白、凝血因子及酶的活性。[0021] 本发明还具有如下优点：[0022] 1、有机溶剂和去污剂联合应用，能快速有效去除部分病毒，且该病毒处理方式使用方便，简单易操作；[0023] 2、本工艺中通过药用级植物油的萃取方法能简便而有效的对有机溶剂和去污剂残留进行除去处理，达到《中国药典》2010版对这两种试剂残留量的要求；[0024] 3、使用该方式处理后的原料血浆，不仅降低血液制品二次污染的几率，提高安全性，同时能有效保持各种蛋白、凝血因子及酶的活性，不影响后续生产工艺提取各种蛋白及酶类制品。

[0025] 下面结合附图对本发明的对血液制品的原料血浆进行病毒灭活处理的方法作进一步说明。

4

CN 104367591 A

说 明 书

3/8页

附图说明

图1为本发明方法中原料血浆经有机溶剂和去污剂混匀液处理后的中间品灭活PRV效果动力学曲线图；

[0027] 图2为本发明方法中原料血浆经有机溶剂和去污剂混匀液处理后的中间品灭活Sindbis病毒效果动力学曲线图。

[0026]

具体实施方式[0028] 实施例1

[0029] 采用有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆进行病毒处理。[0030] (1)血浆融化[0031] 从冷库领取符合《中国药典》2010版三部中“血液制品生产用人血浆”规定、并经复检合格且符合检疫期的血浆1668人份(净重：1002.34公斤)，血浆融化在D级洁净区内进行。采用自然融化法或者水浴融化法。水浴融化法的水温应控制在37℃以下。[0032] (2)血浆合并[0033] 合并血浆，血浆合并在D级洁净区内进行，合并之前，应对血浆袋进行消毒处理，即用75％酒精浸泡三分钟以上，用干净纱布将血浆袋外部酒精擦净后才能合并。合并血浆时，应注意点滴回收，合并后混合血浆体积为965.5升。[0034] (3)将混合血浆温度控制在24±2℃，加入250mmol/L的CaCl2溶液7.8毫升，搅拌10分钟后使用孔径1um的滤芯过滤澄清；[0035] (4)收集滤液963升，按体积比30:1加入浓度为30％的吐温-80(tween-80)和9％磷酸三丁酯(TNBP)混合液32.1升。保持反应液的温度，控制在24±2℃，恒温4-6小时。[0036] (5)恒温时间结束后，根据反应液体积，加入药用级的植物油49.8升，降低反应液温度至16±2℃。

[0037] (6)快速搅拌15分钟，静止放置30分钟，使得油液相完全分层；[0038] (7)使用隔离泵从混合液底部进行抽提，弃除油相。得到经病毒处理后的原料血浆990升。

[0039] 病毒处理后的血浆质量标准[0040] 1、所用血浆原料应符合《中国药典》2010版三部中“血液制品生产用人血浆”规定；

[0041] 2、蛋白含量

[0042] 可采用双缩脲法(《中国药典附录》附录ⅥB第三法)测定，应不低于5.0％。[0043] 3、因子效价测定

[0044] 3.1人凝血因子Ⅸ效价测定[0045] 依法测定(2010年版《中国药典》三部附录X L),每1ml人凝血因子Ⅸ效价不低于0.7IU。

[0046] 3.2人凝血因子Ⅱ效价测定[0047] 依法测定(2010年版《中国药典》三部附录X J),每1ml人凝血因子Ⅸ效价不低于0.5IU。

5

CN 104367591 A[0048]

说 明 书

4/8页

3.3人凝血因子Ⅶ效价测定[0049] 依法测定(2010年版《中国药典》三部附录X K)，每1ml人凝血因子Ⅸ效价不低于0.5IU。

[0050] 3.4人凝血因子Ⅹ效价测定[0051] 依法测定(2010年版《中国药典》三部附录X M)，每1ml人凝血因子Ⅸ效价不低于0.7IU。

3.5人凝血因子Ⅷ效价测定[0053] 依法测定((2010年版《中国药典》三部附录X N)，每1ml人凝血因子Ⅸ效价不低于0.7IU。[0054] 4、HBsAg

[0055] 用经批准的试剂盒检测，应为阴性。[0056] 5、HIV-1/HIV-2抗体

[0057] 用经批准的试剂盒检测，应为阴性。[0058] 6、HCV抗体

[0059] 用经批准的试剂盒检测，应为阴性。[0060] 7、无菌试验

[0061] 依法测定(2010年版《中国药典》三部附录XII A)检定，应符合规定。[0062] 8、磷酸三丁酯残留量[0063] 依法测定(2010年版《中国药典》三部附录VI J)，应不高于10μg/ml。[00] 9、聚山梨酯80残留量[0065] 依法测定(2010年版《中国药典》三部附录VI H)应不高于100μg/ml。[0066] 一、有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆病毒处理效果验证[0067] 根据《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》(国药监注〔2002〕160号)文件的精神，我公司对三批人原料血浆的病毒灭活处理工艺进行了验证，验证的结果如下：

[0068] 1、有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆灭活PRV(伪狂犬病毒)验证结果见表1及图1，由表1可以看出，三批中间品，经过该灭活处理方法(0.3％TNBP+1.0％Tween-80,25±1℃,6小时)病毒灭活后，残余PRV滴度均低于本试验最低检测限(-0.5LgTCID50/0.1ml).可灭活所加指示病毒PRV分别为：20140301批≥4.87LgTCID50/0.1ml，20140302批≥4.75LgTCID50/0.1ml，20140303批≥4.81LgTCID50/0.1ml。取4小时、6小时最低稀释度孔中的上清用于PK－15细胞盲传三代，未见特异性细胞病变(CPE)。

[0052]

2、有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆灭活Sindbis(辛巴氏病毒)验证结果见表2及图2，由表2可以看出，三批中间品，经过该灭活处理方法(0.3％TNBP+1.0％Tween-80,25±1℃,6小时)病毒灭活后，对Sindbis病毒发生了显著灭活作用.可灭活所加指示病毒Sindbis病毒分别为：20140301批≥4.95LgPFU/ml，20140302批≥4.81LgPFU/ml，20140303批≥4.87LgPFU/ml。取4小时、6小时最低稀释度样品用于BHK－21细胞盲传三代，未见特异性细胞病变(CPE)。[0070] 二、有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆灭活PRV病毒效果验证报告

[0069]

6

CN 104367591 A[0071]

说 明 书

5/8页

制品名称：多人份混合原料人血浆[0072] 验证用样品：原料血浆病毒处理后的中间品[0073] 样品批号：20140301；20140302；20140303。[0074] 生产单位：同路生物制药有限公司[0075] 验证依据：《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》[0076] (国药监注〔2002〕160号)[0077] (一)、PRV病毒灭活效果验证试验方案[0078] 1、验证目的：

[0079] 验证有机溶剂和去污剂混匀液(0.3％TNBP+1.0％Tween-80，25±1℃，6小时)对多人份混合原料人血浆中指示病毒PRV病毒的灭活效果。[0080] 2、验证样品

[0081] 病毒处理后的中间品取自生产过程中有机溶剂和去污剂混匀液处理之前一步，于-20℃保存。样品的主要质量参数见表3。[0082] 表3.样品的主要参数

[0083]

3、指示病毒及其培养

[0085] 指示病毒：伪狂犬病毒(PRV病毒)[0086] 病毒滴度：7.08Lg TCID 50/ml，-70℃保存。[0087] 培养用细胞：PK-15细胞。[0088] 4、病毒灭活验证步骤

[00] 4.1将样品放入25±1℃水浴慢慢融化。[0090] 4.2对照样品

[0091] 分别吸取三批未加有机溶剂和去污剂混匀液样品各4.5ml，加入0.5ml PRV病毒，混匀，留取1ml作0h对照，其余4ml混合液置于25±1℃水浴下振摇保温6h，取样作为6h对照。

[0092] 4.3处理样品

[0093] 分别吸取三批已加有机溶剂和去污剂混匀液样品各10.8ml，加入1.2ml PRV病毒，混匀，分装12管，1ml/管，置于25±1℃水浴振摇保温，分别于15min、30min、1h、2h、4h、6h取样，每次取2管。[0094] 4.4终止对照样品

[0095] 分别吸取三批已加有机溶剂和去污剂混匀液样品各2ml，混匀，同处理样品在25±1℃水浴振摇，6h后取样，滴定时加入PRV(按9：1添加)与其他样品同测。[0096] 4.5细胞盲传三代

[0084]

7

CN 104367591 A[0097]

说 明 书

6/8页

取经有机溶剂和去污剂混匀液处理4h、6h后，接种细胞不出现病变的样品,以其对应的最低稀释度孔中样品的上清用于PK-15细胞盲传三代，观察有无特异性细胞病变。[0098] (注：所有样品取样后立即用含有4％小牛血清的细胞培养液以1：100稀释，过滤除菌、分装。-70℃保存备测。)[0099] 5、病毒滴定方法

[0100] 采用微量细胞培养法,在96孔微量培养板上进行,以终点稀释法滴定病毒，每1稀释度接种8孔PK-15细胞,根据CPE判定结果,按Karber公式计算病毒滴度。[0101] (二)、病毒灭活验证结果[0102] 1、原料血浆经有机溶剂和去污剂混匀液处理后的中间品灭活PRV病毒效果(表1)[0103] 表1有机溶剂和去污剂混匀液处理灭活PRV病毒效果

[0104]

注：本实验最低检测限为-0.50LgTCID50/0.1ml

[0106] 3、未表现PRV病毒－CPE样品盲传三代结果(表4)[0107] 表4未表现PRV病毒-CPE变样品盲传三代结果

[0105] [0108]

[0109] “－”表示阴性[0110]

三、有机溶剂和去污剂混匀液对多人份混合人血浆灭活Sindbis病毒效果验证报

告

制品名称：多人份混合原料人血浆[0112] 验证用样品：原料血浆病毒处理后的中间品[0113] 样品批号：20140301；20140302；20140303。

[0111]

8

CN 104367591 A[0114]

说 明 书

7/8页

验证依据：《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》(国药监注〔2002〕160号)[0115] (一)、病毒灭活效果验证试验方案[0116] 1、验证目的

[0117] 验证有机溶剂和去污剂混匀液(0.3％TNBP+1.0％Tween-80,25±1℃,6h)对多人份混合原料人血浆中指示病毒sindbis病毒的灭活效果。[0118] 2、验证样品

[0119] 原料血浆病毒处理后的中间品取自生产过程中有机溶剂和去污剂混匀液处理之前一步，于-20℃保存。样品的主要质量参数见表5。[0120] 表5.样品的主要质量参数

[0121]

3、指示病毒及其培养

[0123] 指示病毒：辛巴氏病毒(Sindbis)[0124] 病毒滴度：6.75LgPFU/ml，-70℃保存。[0125] 培养用细胞：BHK-21细胞。[0126] 4、病毒灭活验证步骤

[0127] 4.1将样品放入25℃水浴慢慢融化。[0128] 4.2对照样品：

[0129] 分别吸取三批未加有机溶剂和去污剂混匀液样品各4.5ml，加入0.5ml Sindbis病毒(滴度为7.23LgPFU/ml)，混匀，留取0.2ml作0时对照，其余混合液置于25℃水浴下振摇6小时，取样作为6小时对照。[0130] 4.3处理样品：

[0131] 分别吸取三批已加有机溶剂和去污剂混匀液样品各10.8ml，加入1.2ml Sindbis病毒(滴度为6.75LgPFU/ml)，混匀，置于25±1℃水浴中振摇，分别于15min、30min、1h、2h、4h、6h取样。

[0132] 4.4终止对照样品：

[0133] 分别吸取三批已加有机溶剂和去污剂混匀液样品各1ml，按1：9加入Sindbis病毒，混匀，分装，-70℃保存备测。[0134] 4.5细胞盲传三代

[0135] 经有机溶剂和去污剂混匀液处理4小时、6小时后接种细胞不出现病变的样品,取其对应的最低稀释度孔中样品的上清用于BHK-21细胞盲传三代，观察有无特异性细胞病变。

[0136] (注：所有样品取样后立即用含有4％小牛血清的细胞培养液以1：100稀释，过滤

[0122]

9

CN 104367591 A

说 明 书

8/8页

除菌、分装。-70℃保存备测，每批样品须至少重复测定二次。)[0137] 5、病毒滴定方法

[0138] 采用BHK-21细胞蚀斑形成法，BHK-21细胞,接种6孔板中,细胞浓度105/ml,48h后细胞长满单层接种待测样品,37℃吸附60min,加覆盖物,数天后结晶紫染色,计数蚀斑数,确定病毒滴度，单位Lg PFU/ml。(二)、病毒灭活验证结果[0140] 1、原料血浆经有机溶剂和去污剂混匀液处理后的中间品灭活PRV效果(表2)[0141] 表2.有机溶剂和去污剂混匀液处理灭活PRV效果

[0139] [0142]

2、未表现Sindbis病毒病变样品盲传三代结果(表6)

[0144] 表6.未表现Sindbis病毒病变样品盲传三代结果

[0143] [0145]

[0146] “－”表示阴性

本发明内容中，很多参数都是一个范围，实施例中虽然有些仅用了个别具体数值来说明，但研究发现，这个范围的所有数值的试验结果都得到了与本发明实施例相似的结论。

[0148] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

[0147]

10

CN 104367591 A

说 明 书 附 图

1/1页

图1

图2

11