肝癌组织中c-myc基因突变的研究

李莉;刘利锋;武彦宁;李庆;陈德喜

【摘 要】目的 检测肝细胞癌中c-myc的DNA苏氨酸58(T58)和丝氨酸62(S62)的突变情况,以揭示肝癌发生发展的机制.方法 应用聚合酶链反应(PCR)方法,检测例肝癌组织及癌旁组织中c-myc基因的T58和S62的突变情况.结果 在例肝癌组织及癌旁组织中未见c-myc的T58或S62及周围氨基酸突变,但发现c-myc的DNA水平与原发性肝细胞癌(HCC)的病理分级存在一定关系,低分化组(87.5%,21/24)、中分化组(74.4%,29/39)及高分化组(53.8%,14/26)与c-myc阳性率差异有统计学意义(P<0.05).结论 c-myc基因的表达与HCC的病理分级存在一定关系,其在肝癌组织的高表达不是由于T58或S62的突变导致c-myc稳定性增高所致,亦有其他的因素参与其中. 【期刊名称】《临床荟萃》 【年(卷),期】2013(028)009 【总页数】3页(P976-978)

【关键词】癌;肝细胞;基因,c-myc;苏氨酸;丝氨酸;基因突变 【作 者】李莉;刘利锋;武彦宁;李庆;陈德喜

【作者单位】首都医科大学附属北京佑安医院,性病艾滋病实验室,北京,100069;首都医科大学附属北京佑安医院,性病艾滋病实验室,北京,100069;北京市肝病研究所,北京,100069;首都医科大学附属北京佑安医院,性病艾滋病实验室,北京,100069;北京市肝病研究所,北京,100069

【正文语种】中 文 【中图分类】R735.7

自20世纪90年代起,原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发病率已越居我国各种肿瘤的第2位。HCC的发病原因与乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染、黄曲霉素、酒精、遗传等诸多因素有关,但具体机制不明[1]。C-myc基因是研究最多的原癌基因之一,与细胞的增殖、分化、凋亡有关,其表达的异常与肿瘤的发生发展有关[2],在人类的大多数癌症中,均有c-myc的过表达。C-myc的过表达往往归因于c-myc基因的增强或基因的转位(转位于高转录活性的区域)[3],但是,c-myc泛素化过程(降解过程)的异常,同样可以导致c-myc的过表达。在多数情况下,泛素化过程与靶蛋白的磷酸化过程紧密相连,c-myc的磷酸化位点为苏氨酸58(T58)和丝氨酸62(S62),这两个位点的突变,在Burkitt淋巴瘤中与c-myc的过表达有关[4]。那么,T58和S62的突变在HCC中是否存在,是否与肝癌的发生、发展有关呢?本研究通过聚合酶链反应(PCR)测序的方法检测例HCC组织及其相应的癌旁组织中c-myc基因的表达,探讨cmyc基因的突变与HCC发生、发展的关系。

1.1病例选择 收集首都医科大学附属北京佑安医院2008年1月至2010年12月HCC手术切除标本,手术切除后半小时内立即置于-135℃冰箱保存待用。癌组织和癌旁组织(距肝癌癌灶边缘3～5 cm处取材)各例,其中男例,女25例,男∶女= 2.56∶1。年龄27～83岁,中位年龄56岁。肿瘤直径≤5 cm者37例,＞5 cm者52例;乙型肝炎表面抗原(HBs Ag)阳性59例,HCV抗原阳性19例,二者均为阳性9例,情况不明11例。HCC的Edmondson病理分级:Ⅰ～Ⅱ级(高中分化)65例,其中高分化26例,中分化39例;Ⅲ～Ⅳ级(低分化) 24例;合并肝硬化57例,慢性肝炎32例。所有肝癌患者术前均未接受任何放射治疗和化学治疗。所选标本均经病

理确诊为HCC。

1.2试剂与仪器 DNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司。应用美国Bio-Red PTC200PCR仪进行PCR检测。PCR引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR产物由北京博迈德科技发展有限公司进行测序。主要试剂DNA(TaqDNA)聚合酶,脱氧核糖核酸(d NTP),10×PCR缓冲液等均为Takara公司产品。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.3HCC及癌旁组织DNA提取 从石蜡肝癌标本中应用QIAGEN DNA提取试剂盒进行DNA的提取。具体方法:将石蜡组织切成4～10μm的薄片,放入1.5 ml离心管中,组织的量不能少于25 mg;加入1.2 ml二甲苯,涡旋震荡,室温放置3分钟,全速离心5分钟,小心弃上清;加入1.2 ml乙醇(96%～100%),轻柔涡旋,全速离心5分钟,小心弃上清;重复上一步;置于37℃10～15分钟,直至乙醇挥发完;加入裂解液(ATL)180μl重悬组织;加入20μl蛋白酶K,涡旋混匀,56℃水浴直至组织溶解;加入ATL液200μl,混悬15秒,70℃水浴10分钟;加入0.2 ml乙醇(96%～100%),涡旋震荡15秒;将上述混合液加入到QIAamp离心柱中,8 000 r/min离心1分钟,弃去液体;向柱内加入500μl漂洗液(AW1),8 000 r/min离心1分钟,弃去液体;向柱内加入500μl漂洗液(AW2),14 000 r/min离心3分钟,弃去液体;更换新的收集管,空转1分钟;将离心柱放入一个1.5 ml的离心管中,向柱内加入200μl洗脱液(ATE),室温放置1分钟,8 000 r/min离心1分钟;将1.5 ml的离心管中的液体重新加入到离心柱,重复上一步骤,弃去离心柱,所得液体即为DNA。

1.4HCC及癌旁组织标本中c-myc的DNA检测 本研究采用普通PCR方法,c-myc的正向引物序列为: 5′-CCTCCCGCGACGATGCCCCTCAAC-3′,反向引物序列为:5′-GGAGAAGCTCCCGCCACCGCCGTC-3′。反应体系为:10倍PCR缓冲液5μl,d NTP 4μl(2.5 mmol/L),c-myc上游和下游引物各0.5μl(各20 μmol),dd H2O(37.5μl),DNA聚合酶0.5μl,制成DNA模板2μl,总体积50μl,混匀离心置于

DNA扩增仪(PTC200)内反应。PCR反应参数为:95℃预变性5分钟,95℃变性30秒,65℃退火30秒,72℃延伸45秒,共40个循环。PCR产物经溴化乙啶染色后激光扫描进行灰度比较。同时,PCR产物送公司测序。

1.5统计学方法 应用SPSS 16.0软件系统进行统计分析。率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1PCR扩增产物和测序PCR扩增产物电泳结果

经溴化乙啶(EB)染色后紫外灯下显示可见1条c-myc电泳带,在300 bp左右(理论值为290 bP)。例HCC组织中例阳性(100%),其中强阳性占58.4%(52/),弱阳性占9.0%(8/)。例HCC癌旁组织中80例阳性(.9%),其中强阳性占33.8%(27/80),中度阳性占50.0%(40/80),具体结果见图1。

将肝癌组织和癌旁组织标本中PCR扩增阳性的标本送公司测序,经PUBMED的序列(BLAST)比对,未发现各临床标本中c-myc的T58和S62位点上发生突变,见图2。 2.2C-myc的表达与临床特征的关系 经统计学检验HCC组织与癌旁组织中c-myc的表达在不同的病理分级中差异有统计学意义(P＜0.05),见表1。

C-myc作为一个转录因子,能有效地细胞的生长、增殖、分化和调节。在转录阶段(启动和延长),转录后阶段(m RNA稳定性和翻译)和翻译后水平(蛋白质稳定性)等每一个可能的阶段都可以调节c-myc的表达。C-myc表达产物的降解在人类疾病的发生中具有突出的作用,在人类大多数癌症中都有c-myc的过度表达[5]。因此,c-myc蛋白稳定性的在癌症的发生与发展中的作用非常重要。这种稳定作用需要Ras信号蛋白的激活作用。Ras下游的效应物,即Raf的激活也可以通过Raf-MEK-ERK激酶级联来稳定c-myc,揭示磷酸化也可能参与调节c-myc的稳定性[6]。

C-myc的磷酸化的位点有T58和S62,位于c-myc N末端。S62是细胞外受体激酶(ERK)的作用位点,T58是糖原合成激酶(GSk-3β)的靶点(苏58被GSk-3β识别),

因此,这些位点的磷酸化过程都是通过激活Ras信号通路来进行的。通过研究S62和T58磷酸化后的效应与c-myc蛋白稳定性之间的关系发现:S62磷酸化可以稳定c-myc,而T58磷酸化降低c-myc的稳定性[7-8]。C-myc的稳定性还与它的降解有关,在c-myc蛋白特异降解通路上PP2A和c-myc E3泛素连接酶扮演着重要的角色[8],而且与c-myc第58位氨基酸-苏氨酸的磷酸化相关联。许多肿瘤细胞具有高水平的c-myc蛋白质表达而没有m RNA水平的升高,因此,c-myc降解相关的信号蛋白诸如Ras,ERK,GSK-3,PP2A和脯氨酰异构酶(Pin1)的活性异常可能与人肿瘤的发生发展相关联。本研究发现HCC细胞和正常细胞比较,多数肝癌患者的肝癌细胞c-myc蛋白表达明显增高,因此,推断c-myc蛋白稳定性和肝癌的发生发展存在显著相关性,推测c-myc DNA序列中T58或S62及周围氨基酸可能存在突变。因此,检测了c-myc的T58或S62及周围氨基酸突变,以便了解其突变是否和肝癌发生发展存在一定关系。本研究结果显示:在检测的例HCC标本中,未发现c-myc的T58或S62及周围氨基酸突变。这一结果与Zhang等[9]的结果一致,均未在实体肿瘤中发现c-myc的T58或S62突变,这与在Burkitt淋巴瘤[10-11]中发现不同,但本研究显示c-myc的DNA阳性比例与HCC的病理分级存在一定关系,高、中、低分化组的c-myc的DNA量差异具有统计学意义,这一结果预示着c-myc的高表达与HCC的发生存在一定的关系,但c-myc的这种高表达不是由于T58或S62的突变导致c-myc稳定性增高所致,可能其他的原因参与c-myc高表达,需要进行进一步的深入研究,这对寻找HCC的发病机制和新的治疗方法具有重要的临床和现实意义。

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