黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数

作者：2006级生物工程专业刘强

指导教师：杜志兵工程师

摘要：本实验旨在利用微生物固体发酵技术，以廉价农产品副产物作为发酵培养基,大量制备黑曲霉菌体，用于有机物料腐熟剂的生产，并检测产品的有效活菌数。首先以济宁三环化工生产用黑曲霉菌种作为原始菌种，采用平板划线技术，进行菌种的分离筛选；将获得的纯系菌株接入豆芽汁液体培养基中，开始摇瓶扩大培养；然后选择合适的摇瓶培养物作为固体发酵菌种，接入固体发酵基质中，进行曲盒发酵；发酵结束后，黑曲霉生产接种量为1‰。最后对腐熟剂产品依据GB20287-2006农用微生物菌剂标准中有效活菌数的测定方法进行检测。结果表明，发酵所产黑曲霉在质量和数量上符合腐熟剂生产标准，产品有效活菌数检测结果符合行业标准的规定，且操作规范、重复性高、结果准确可靠。关键词：固体发酵；黑曲霉；有效活菌数；测定Abstract:Thisstudywasdesignedtousesolidmicrobialfermentationtechnologytolow-costagriculturalby-productsasfermentationmedium,largescalepreparationofAspergillusnigerbiomass,decompositionoforganicmaterialsusedintheproductionofagentsandthenumberofactivebacteriadetectionproducts.Jiningfirsttousethree-ringchemicalproductionastheoriginalstrainofAspergillusnigerstrains,usingflatcrossedtechnologyforStrains;strainswillbeofpurelyphysicalmediumaccessbeansproutjuice,beganexpandingcultureflask;andthenselecttheappropriatecultureflaskasasolidfermentationbacteria,accesssolidsubstratefermentation,fermentationmarchboxes;fermentationafterinoculationofAspergillusnigerproducing1‰.Finally,thedecompositionagentagriculturalproductsaccordingtoGB20287-2006standardmicrobiologicalagentsDeterminationofthenumberofactivebacteriaweredetected.TheresultsshowthatthefermentationproducedbyAspergillusnigerinthequalityandquantityproductionstandardsconsistentwithdecompositionagent,theproductnumberofactivebacteriatestresultsmeetindustrystandardrequirements,andoperatingspecifications,reproducible,accurateandreliable.Keywords:solidstatefermentation；Aspergillusniger；effectiveviablecount；determination-1-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测1前言秸秆、人畜粪便、生活垃圾、工业废渣等各种有机废弃物是数量巨大的可再生资源，绝大部分没被充分有效利用，不仅导致严重的环境污染，而且造成资源的巨大浪费。施用有机物料腐熟剂，就是通过大量功能微生物（黑曲霉、绿色木酶、枯草芽孢杆菌等优良菌团）的分解、转化作用，将上述有机废弃物进行快速肥料化，是一条简便易行、提高土壤肥力、减少化肥用量、增加农业收入、促进农业可持续发展的有效途径。

黑曲霉（Aspergillusniger），半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。分生孢子梗自基质中伸出，直径15～20pm，长约1～3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。菌落蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状。背面无色或略带黄褐色。有时在新分离的菌株中能找到白色、圆形、直径约1mm的菌核。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。顶囊球形，双层小梗。分生孢子褐色球形。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。

本文以黑曲霉的固态发酵工艺为例，阐述有机物料腐熟剂的生产及检测过程。固体发酵是指微生物生长在潮湿不溶於水的基质进行发酵，在固体发酵过程中不含任何自由水，随著自由水的增加，固体发酵范围延伸至黏稠发酵(slurryfermentation)以及固体颗粒悬浮发酵。固态发酵起源于中国，具有几千年的历史。近年来，由于固态发酵具有节水、节能的独特优势，属于清洁生产技术、逐步得到世界各国的重视。

固体发酵技术发展已久,应用广泛。在古代中国就已经被应用在制曲酿酒、腌制食品、肥料堆积等方面。受科技发展的，在过去的很长一段时间内固体发酵技术都停留在一个比较原始落后的状态，甚至在现代的工业生产上仍然在沿用这样的发酵技术。不过在最近十年间，关于固体发酵技术的研究和应用得到了迅速发展。在20世纪九十年代就有有关固体发酵技术近1000篇的研究论文和许多著作出版。在21世纪初，固体发酵技术的相关研究论文数量增加更多。固体发酵技术分为两

-2-山东农业大学学士学位论文种：固体发酵（SolidStateFermentation）和固体基质发酵（SolidSubstrateFermentation）。其优势有以下几点：首先，固体发酵使用的培养条件相对粗放，而且培养基只需要比较简单的前期处理；其次，工业生产的资金投入比较小，尤其在工业生产前期投入少，利于规模化生产；另外，固体发酵的产品性能较好、而且工业生产时环境污染比较小，更有利于生物循环。固体发酵技术的应用提供了很有潜在优势的发酵方式，其在产品生产上技术含量的增加，也提高了产品的附加值。而且固体发酵生产的产品，如酶、生物活性复合物、免疫抑制剂等的价格也要较液体发酵产品为高，该技术的应用推广定能够创造更多社会价值。固体发酵技术已经取得了不小的进步，但是依然存在许多不足，发酵过程条件控制，尤其是该技术在工业生产过程中的许多应用问题，都有待进一步解决。固体发酵技术的应用推广还是一个任重而道远的工作，有待更多的研究工作的开展。

真菌进行固体发酵具有很大的优势：1.能在较低含水分下生长(适水活性在0.7-0.93-0.98)，而细菌与酵母菌的适水活性则大于0.99。2.细菌一般在低pH下就不易生长，而一般真菌能在低pH下也能生长良好。而固态培养基的pH很难，故真菌的此项特点有利于固体发酵。3.固态基质常为大分子化合物，如淀粉、纤维素、半纤维素、果胶、木质素、蛋白质和脂质等，真菌常能分泌这类的胞外分解酵素而利用其周围的培养基质作为碳源及氮源。4.真菌若具有产孢特性，则易于存放及接种，人员不需要太多训练即能进行孢子接种工作。5.菌丝的生长模式优于单细胞的生长方式，菌丝顶端延伸并分枝产生新的菌丝端，能迅速覆盖固体基质表面而有效利用基质。6.菌丝有分隔者，能透过孔洞(septalpore)传送物质，遇危险则孔洞自动封住，以避免细胞质流失；若为无分隔者，其细胞质内物质的传送迅速而使菌落快速繁衍。7.菌丝的生长渗透到固体培养基的力量强，形成很高的机械压力，配合尖端分泌的水解酵素，使穿入固体基质容易。

本文系统的阐述了黑曲霉固体发酵的工艺流程，从菌种制备到发酵结束的全过程，同时在实践基础上，对出现的问题加以了解释，具有较强的可操作性。

2材料与方法2.1原始菌种

实验用黑曲霉菌种（Aspergullusniger）由济宁三环化工有限公司技术中心提供。

-3-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测2.2培养基

2.2.1斜面培养基配方：干料

琼脂条

100—200g20g

水

1000ml

6的比例进行混合均匀称为干料，麸皮与稻糠按4∶将干料放在水中煮沸30min，用单层纱布滤去杂质，补充水分，加入剪碎的琼脂条，加热，琼脂条溶解之后，分装到18×150mL的试管中，每支试管加入5mL，121℃、0.1Mpa，灭菌1h。灭菌结束之后，将试管按照一定的倾斜度摆放，使培养基共占据试管长度1/2，培养基凝固之后即可使用。2.2.2分离纯化培养基

PDA固体培养基，配制时加入氯霉素（100μg/ml），pH自然，121℃、0.1Mpa，灭菌30min，冷却至50℃倒平板。2.2.3种子扩大培养基豆芽汁液体培养基：蔗糖

20g

黄豆芽

100g

水

1000ml

先将洗净的豆芽放在水中煮沸30min，用两层纱布滤去豆芽，得豆芽汁，补充水分，加糖，并搅拌溶解，调节pH至7.2，装入1000ml三角瓶中，500ml/瓶，121℃、0.1Mpa，灭菌30min，冷却待用。2.2.4固体发酵基质

麸皮与水按照10﹕7的比例进行搅拌均匀，然后装入铁制曲盒中（每个曲盒装入1.5kg），曲盒内下置灭菌湿纱布，上盖灭菌帆布，置蒸箱内灭菌4h，待冷却后，接入菌种。

2.2.5cfu检测培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠水1000ml，pH7.2。

马铃薯固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH自然，水1000ml，另加氯霉素0.1g。

-4-5g，琼脂15—20g，

山东农业大学学士学位论文高氏一号培养基：可溶性淀粉20g,钾1g，氯化钠0.5g,磷酸氢二钾0.5g,硫酸镁0.5g,硫酸亚铁0.01g,琼脂20g,水1000ml，pH7.2，临用前加入重铬酸钾溶液（54μg/ml）。

2.3试剂和仪器

超净工作台（SW—CJ—2FD型，上海实业有限公司）恒温培养箱（DHP—9082型，上海一恒科技有限公司）

手提式压力蒸汽灭菌器（YXQG02型，山东新华医疗器械股份有限公司）电子精密天平（JA12002型，上海精天电子仪器有限公司）旋转气浴振荡箱（SHZ—85型，金坛市大地自动化仪器厂）电热式面包发酵箱（HM—14/530型，上海恒麦食品机械有限公司）箱式和面机（HWT50型，山东省章丘市炊具机械总厂）

接种环，酒精灯，玻璃涂棒，移液及头，铁制曲盒，蒸箱，温湿度计，光学显微镜，冰箱，试管架等；

无菌水试管（9ml/支），带玻璃珠的250ml无菌水三角瓶（100mL/瓶），75%酒精，石炭酸复红染液，氯霉素，3%重铬酸钾溶液等。

2.4实验方法

2.4.1黑曲霉的分离纯化

保藏在试管斜面上的黑曲霉菌种通常由于斜面培养基灭菌不彻底或保管不善等而含有杂菌（细菌），在黑曲霉本身的覆盖作用下，不易觉察，因此必须对黑曲霉原始菌种进行分离筛选。一般采用平板划线的方法进行分离，先获得孢子母液，再系列稀释，选一合适稀释度进行平板划线，最后将分离得到的纯系菌种保藏在斜面培养基上。

2.4.1.1培养基制备

（1）将PDA固体培养基（含氯霉素100μg/ml），加热溶化，冷至55—60℃时，倒平板7皿，室温放置2d，无菌落即可使用。

（2）配制斜面培养基（稻糠培养基），分装至18×150mL的试管中，每支5ml，共8支，高压蒸汽灭菌1h后，搁置斜面，凝固后待用。2.4.1.2系列稀释

-5-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测（1）取一试管黑曲霉原始菌种，用无菌水将斜面浸没，并充分振荡，将斜面上的黑曲霉孢子洗脱，制备黑曲霉孢子母液。

（2）取4支9ml无菌水试管，分别标注“10-1”、“10-2”、“10-3”、“10-4”。（3）用一支1ml无菌移液吸取上述黑曲霉孢子母液1ml，加入“10-1”的无菌水试管中，充分混匀，此即为101稀释液，以此类推制成102、103和104几种稀释液的黑曲霉孢子稀释液。2.4.1.3平板划线

（1）取7个PDA平板，依照10-3和10-4两个稀释度，分别标注为“3—1”、“3—2”、“3—3”和“4—1”、“4—2”、“4—3”，另留一平板作空白对照。（2）将接种环在酒精灯上反复灼烧，冷却后，用接种环无菌操作挑取上述10-4黑曲霉孢子稀释液一环，在酒精灯无菌圈内于PDA平板上划四组首尾相交的平行线。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于恒温箱中，30℃培养5d。（3）在6培养皿平板上依次划线，分别培养5d。2.4.1.4斜面保藏

（1）打开超净工作台，酒精擦拭内壁后，紫外线灭菌半小时，开无菌风。操作前，先用75%酒精擦拭双手，待酒精挥发后，点燃酒精灯。

（2）取出上述六个PDA平板，选择长有较大且丰满菌落的平板4—2（103平板生长过密，不可用），作为接种平板。

（3）反复灼烧接种环，充分冷却后，用接种环刮取少量菌苔，迅速将沾有菌种的接种环伸入斜面试管中，在斜面上划波浪线。然后将接种环抽出，灼烧试管口，塞上棉塞。

（4）将斜面试管置30℃恒温箱中，培养5d，待斜面布满炭黑色孢子后，取出，置4℃冰箱中保存。

2.4.21000ml三角瓶扩大培养

将斜面菌种进行扩大培养，以获得大量黑曲霉菌体用于下一步的发酵生产，扩大培养采用液体的豆芽汁培养基进行摇瓶扩大。

-6------

山东农业大学学士学位论文2.4.2.1培养基制备

将1kg新鲜黄豆芽放入锅中加水煮沸30min，过滤得豆芽汁。取1000ml洁净三角瓶20个，每瓶装豆芽汁500ml，并按3%的量加入白砂糖（15g），加棉塞，用报纸包扎，放入灭菌锅中，灭菌30min，取出冷却待用。2.4.2.2接种

（1）将冷却后的豆芽汁液体培养基放入超净工作台中，同时将纯化后的黑曲霉菌种（外用报纸罩住）、接种环等一起放入，紫外线灭菌30min后，开无菌风。操作前，用75%酒精擦拭双手，待酒精挥发后，点燃酒精灯。

（2）反复灼烧接种环，充分冷却后，用接种环刮取少量菌苔，迅速将沾有菌种的接种环伸入三角瓶中，搅拌，然后将接种环抽出，灼烧试管口，塞上棉塞。（3）将三角瓶放入摇床，30℃、200r/min，培养3d。2.4.3曲盒发酵

2.4.3.1固体发酵基质制备

（1）按麸皮与水10﹕7的比例称取固态基质15kg，即称取麸皮8.8kg，水6.2kg（6200ml），将其放入箱式和面机中搅拌5min，待手感湿度适宜后，停止搅拌。（2）取铁制曲盒10个，用75%酒精内外洗刷一遍，晾干后使用。取70×50cm的纱布和白帆布各10个，浸湿后，置高压蒸汽灭菌锅内，灭菌30min，冷却待用。（3）将曲盒平放，用灭菌湿纱布铺在曲盒底部，然后加入搅拌均匀的固态基质，每盒1.5kg，共10盒。基质在曲盒内平铺均匀。最后曲盒上部盖上拧干水分的灭菌湿纱布。

（4）将上述10个曲盒放入蒸箱内，灭菌4h，期间需有人员看守，防止蒸箱内水分干涸，使麸皮烧焦。

（5）灭菌结束后，取出曲盒冷却至室温，即可接种。2.4.3.2接种

（1）选择合适的摇瓶培养物，要求菌液无杂菌污染，菌丝球大小合适（约0.7cm，过大菌体数量少，不利于发酵）。

-7-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测（2）吸附双手戴一次性塑料手套，将菌液倒入固态基质中，边倒入边用手搅

拌均匀，每两瓶菌液接入一盘曲盒中。然后用帆布将曲盒盖住，送往发酵室培养。2.4.3.3发酵

将曲盒放入电热发酵箱中培养，调节初始温度（T）30℃，湿度（RH）58%。待曲盒表面长满黑色菌丝后，发酵结束（约5天）。

发酵管理：发酵过程中，黑曲霉不断地生长繁殖，发酵箱内温度和湿度也会随着黑曲霉的生长呈动态变化，每天早中晚各记录一次温湿度，绘制成曲线，可生动地反映黑曲霉的生长变化情况。2.4.3.4后处理

发酵结束后，将曲盒取出，在室温下晾晒2天，以降低曲料湿度，便于加工运输。

2.4.4有机物料腐熟剂的生产

将黑曲霉、绿色木霉、芽孢杆菌、高低温放线菌等优良菌体，接入腐熟剂基质中，即可制成有机物料腐熟剂。该产品可对秸秆、人畜粪便、工业废渣等有机废弃物进行分解转化，使其快速肥料化，是一条简便易行，提高土壤肥力，减少化肥用量，增加农业收入，促进农业可持续发展的有效途径。

其中，黑曲霉菌种在生产上的接种量为1‰，即1吨中接种1公斤。2.4.5cfu检测

有机物料腐熟剂的有效活菌数量是判断腐熟剂合格与否的重要指标。本实验依据GB20287-2006农用微生物菌剂标准的规定，采用平板计数法，对有效活菌数进行测定，从操作步骤、菌落形态、稀释度设置、计数选择、结果计算与判定规则方面对行业标准的适用性进行了验证，主要检测指标有黑曲霉（DYM）、芽孢杆菌（YGX8）、放线菌（DY-1、DY-2）。2.4.5.1取样

在腐熟剂产品库中抽样，采用随机法抽取。取样500g，装入塑料袋中，密封，标记“F”。2.4.5.2培养基制备

-8-山东农业大学学士学位论文倒平板：牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板各10个，室温放置2d，无菌落长出即可使用。

每组平板按稀释度分别标记为“4—1”“4—2”“4—3”、“5—1”“5—2”“5—3”和“6—1”“6—2”“6—3”，另各组各取一个平板作空白对照。2.4.5.3系列稀释

（1）准确称取腐熟剂样品10.0g（精确到0.01g），加入到带玻璃珠的100mL的无菌水中，静置20min后，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成10-1菌悬液。

（2）用1ml无菌移液分别吸取1mL上述母液的菌悬液加入9mL无菌水中，混匀成1：10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6稀释度的菌悬液（每个稀释度必须更换无菌移液头）。2.4.5.4加样

用0.1mL无菌移液分别吸取“10-4”“10-5”“10-6”稀释度菌悬液0.1mL，分别加至标记有“4—X”、“5—X”和“6—X”牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基、高氏一号培养基表面。

用无菌玻璃涂棒将菌悬液均匀地涂于琼脂平板表面，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照。2.4.5.5培养

加样后，将高氏一号平板、PDA平板放入30℃恒温培养箱中培养；将牛肉膏蛋白胨平板放入35℃恒温培养箱中培养。2.4.5.6菌落计数

在活菌数计算之前，平板菌落数应满足以下两个条件：（1）3个稀释度的平板菌落数成梯度；（2）同一稀释度重复3次的平板上菌落数标准差值应小于允许差值，允许差值见表1。

-9-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测表1平板菌落数允许差值Table1themarginflatcolonies

平板菌落数（个/皿）允许差值30—501051—10020101—30050菌落计数原则：（1）以平板上出现30—300个菌落数的稀释平板为计数标准。（2）当只有一个稀释度、其平均菌落数在30—300之间时，则以该平均菌落以及稀释倍数计数。

（3）若有2个稀释度，其平均菌落数均在30—300之间，应按两者菌落总数之比值来决定。若比值小于2，应计数两者的平均值，若大于2，则计数其中稀释度较小的菌落总数。

（4）若3个稀释度的平均菌落数均大于30，则应以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。

（5）若3个稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。

（6）若3个稀释度的平均菌落数不在30—300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。有效活菌数按下式计算：

nm=XkV1/moV2×10-8nm------质量有效活菌数，单位为亿每克（亿/克）；X------菌落平均数，单位为个；k------稀释倍数；

V1------基础液体积，单位为毫升（ml）；mo------样品量，单位为克（g）；

V2------菌悬液加入量，单位为毫升（ml）；2.4.5.7镜检

根据所检测样品的有关技术资料，通过染色、镜检等技术确认有效菌的菌落形

-10-山东农业大学学士学位论文态和个体形态。

3结果与分析3.1黑曲霉的分离纯化

保藏在试管斜面上的黑曲霉原始菌种，通过系列稀释获得“10-3”和“10-4”两个稀释度的黑曲霉孢子悬液；然后在PDA固体培养基平板上，采用平板划线技术进行分离。在30℃，培养5d。

培养基上菌落初为白色、平坦，后中心微隆、变黄色，再变为棕黑色，菌落表面呈颗粒状，有放射性凹沟、有同心环形，反面为黄至秸黄色、有放射性裂纹，表面的凹沟与反面裂纹相对应。

发现在“10-3”稀释度的3个平板中，由于孢子悬液浓度过大，黑曲霉生长过密，菌体全部或部分覆盖培养基平板，没有发现黑曲霉单菌落；发现在“10-4”稀释度的3个平板中，孢子悬液浓度适宜，有黑曲霉单菌落形成，故可用于菌种的斜面保藏。

将上述平板中的黑曲霉菌株，在无菌条件下，用接种环刮取少量接种到试管斜面上的稻糠培养基中，将斜面试管置30℃恒温箱中，培养5d，待斜面布满炭黑色孢子后，取出，置4℃冰箱中保存。培养所得黑曲霉菌种如图1所示。

另：黑曲霉斜面保藏所用到的培养基为稻糠培养基，即麸皮与稻糠按4∶6的比例进行混合均匀，加水煮沸，过滤而成。普通培养基的灭菌时间一般为30min，但试验表明，稻糠培养基在121℃、0.1Mpa，灭菌30min的情况下，由于麸皮与稻糠本身结构的因素，灭菌往往不够彻底，造成新培养的斜面菌种重新被污染。经长期实验发现，当延长灭菌时间达1h以上时，可灭菌彻底，不发生重复污染。

-11-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测图1黑曲霉试管斜面

Figure1Aspergillusnigertesttubeslant

3.21000ml三角瓶扩大培养

将试管斜面上的黑曲霉菌种，在无菌条件下，接种到冷却后的豆芽汁液体培养基上，在旋转式摇床上，30℃、200r/min，培养3d。获得了大量的黑曲霉菌体，用于下一步的发酵生产。其中，20瓶菌液菌丝球大小合适，无污染，均可用。（如图2）

图2黑曲霉菌丝球

Figure2myceliumofAspergillusniger

-12-山东农业大学学士学位论文3.2.1液体发酵条件对菌丝产量的影响3.2.1.1发酵时间对菌丝产量的影响

黑曲霉菌丝体发酵时间3d，菌丝体长势最好，产量最高。在初期生长比较缓慢，随着发酵进程的不断深入，菌丝体生长越来越旺盛，到第3天菌丝体产量达到最高峰，之后生长趋于稳定。同时，培养3d的液体种子，开始形成大量均匀的菌丝球，表面具放射状小刺，镜检菌丝，有大量的锁状联合，此时菌丝生长正处于增殖期，适宜接种。

3.2.1.2摇瓶装液量对菌丝产量的影响

1000mL三角瓶装液量500mL时,菌丝产量较理想，而装液量600mL，菌丝产量较少，说明装液量过多影响了菌丝体的好氧需求，从而影响菌丝的产量；而装液量过少，菌丝体所能吸收利用的营养不足，也影响菌丝的产量。3.2.1.3摇瓶转速对菌丝产量的影响

在转速为200r/min时，菌丝产量最高。转速慢，培养基内的溶解氧少，菌球过大，而菌球中间的菌丝处于饥饿状态，影响菌丝的生长，致使菌丝的生物量降低。转速过快摇瓶内的机械刺激过于强烈，也影响菌丝的生长，同时转速过高，还容易引起培养液的飞溅，弄湿棉塞，引起污染。3.2.1.4接种量对菌丝产量的影响

接种量少，所形成的大菌球相对就少，随之，菌丝体的产量就少。接种量过多时，小菌球的数量过多，导致培养基内缺氧及培养基内营养成分迅速被消耗，菌丝体无法很好的生长，而影响菌丝体的产量。

3.3曲盒发酵

麸皮与水按照10﹕7的比例搅拌均匀后，装入铁制曲盒中（1.5kg/盒），曲盒内下置灭菌湿纱布，上盖灭菌帆布（如图3），置蒸箱内灭菌4h（如图4），待冷却后，接入菌种。

-13-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测Figure3.3.1

图3发酵基质制备

Preparationofthefermentationsubstrate

图4蒸箱灭菌4h

Figure3.3.2Steamersterilization4h

-14-山东农业大学学士学位论文将上述摇瓶培养所得黑曲霉菌种接入灭菌后的发酵基质中，置于发酵箱中培养5天，记录箱内温湿度变化（如表2与表3）。

表2温湿度随时间变化表

Table2Temperatureandhumiditychangeswithtimetable

时间

5.23

5.24

5.24

5.25

5.25

5.26

5.26（晚）3360%

32.558%5.27

（早）（晚）（早）

温度湿度

3058%

3358%

3958%

3958%

（晚）（早）3960%

34.559%

表3温度随时间变化表

Table3Temperaturechangeswithtimetable

发酵结束后，将曲盒取出，在室温下晾晒2天，降低湿度。结果如图5

-15-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测图5发酵后的黑曲霉

Figure5FermentationofAspergillusniger

3.3.1发酵培养基含水量对菌体生长的影响

发酵基质含水量直接关系到氧气的供应和微生物的生长状态，从而影响菌株产孢量。如果培养基含水量过高，灭菌后培养基易结块成团，通气状况差，不利于产孢子；培养基含水量过低，一方面灭菌时淀粉不易糊化，另一方面水分不足，对菌体生长和产孢子也造成不利影响。经反复实践表明，以加水70%时，即干料与水比例为10∶7，产孢量较为理想。3.3.2最佳接种量

实践过程中发现菌株生长与接种量有很大的关系，接种量过低会使生长缓慢，发酵周期延长，同时增大了染菌机率（主要为根霉污染），而且产孢量低；接种量大时，发酵周期缩短，而过高接种量则会造成生长过快，曲温升高，不利于黑曲霉的产孢。实践结果表明，接种量为“两瓶接一盘”（两瓶上述标准菌液接入一个曲盒中）时，产孢效果较好。3.3.3种龄的影响

实验表明，种龄对菌体生长也有一定影响。从实践过程观察到以70h的三角瓶菌种悬浮液接种最好，其孢子体丰满、活力较强，接种后菌丝体生长均匀，曲温上升缓慢，产孢量高；而30h的液体菌种，主要成分是菌丝体，接种后前期生长过快，曲温不易控制，产孢量明显降低。

-16-山东农业大学学士学位论文3.3.4最佳温度

温度对黑曲霉产孢量影响特别大，39℃时产孢效果较好，变温发酵时产孢量最高。这是因为发酵前期为菌株生长的适应期，温度较高有利于孢子萌发，使适应期缩短；对数生长期菌株生长速度较快，放出大量生物热，因而培养基内部温度升温较快，消耗水分较多，应适当降低温度，加强通气，促进散热；后期大量孢子成熟，发酵基质中的营养降低，菌株生长缓慢，升高温度，可以缩短发酵周期。

3.4有效活菌数检测

对有机物料腐熟剂中有效活菌数检测，主要检测指标有黑曲霉（DYM）、枯草芽孢杆菌（YGX8）、放线菌（DY-1、DY-2）。结果见表4

表4cfu检测结果

检测菌种DetectionofbacteriaDYMYGX8DY-1、DY-2

不同稀释度的平均菌落数Averagecolonyindifutability10-4无法计数无法计数无法计数

10-5无法计数17.722.3

10-6224

菌落总数亿

/gColonysum

0.20.180.22

经过检测本次生产的腐熟剂中，其有效活菌数cfu(亿/g)=DYM+YGX8+DY-12=0.6亿/g。根据有机物料腐熟剂的相关标准（表5）的规定，该产品达到合格。

-17-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测表5有机物料腐熟剂产品的技术指标

Table5decompositionoforganicmaterialsproductspecificationsagent项目

液体

有效活菌数（cfu）亿/g

≧

1.0

剂型粉剂0.50

颗粒0.50

4讨论麸皮是小麦加工过程中产生的主要副产物，具有来源丰富、价格低廉、营养丰富的特点，除富含有纤维素、半纤维素以及蛋白质、脂肪、低聚糖等碳水化合物以外，还含有多种维生素和金属离子，因此，麸皮除可为微生物提供生长所需的碳源和氮源外，其中的B族维生素和生物素以及镁、磷、铁、钙等金属离子还是微生物必需的生长因子。有研究报道，发酵后麦麸粗蛋白、粗纤维等含量均有显著提高，可为黑曲霉后期生长和产孢提供充足养分。同时，麸皮使培养基松散，从而改善通风状态，有利于微生物产孢，故试验选用麸皮作为培养基的主要原料，进行固体发酵。在固体发酵过程中，菌株萌发、生长及繁殖需要消耗水分，菌株代谢产生大量生物热，温度升高，水分蒸发，水活度下降，水量的变化必然会对微生物的生长及繁殖产生主要影响，因此在发酵过程中需要提供合适的水分，满足菌体正常代谢活动和降低发酵温度。

黑曲霉属于丝状真菌,适合采用固态发酵的方式，且是国际上公认的安全菌株。微生物固态发酵具有设备投资少、操作成本低,可使用农副产品作原料、易推广等优点。本实验以廉价农产品副产物作为发酵培养基,采用固体发酵技术，大量制备黑曲霉，所产黑曲霉在质量和数量上符合腐熟剂生产标准。通过长期反复验证，初步确定了黑曲霉固体发酵条件，即麸皮与水按10﹕7比例混合均匀作为发酵培养基；接种量为1000ml/盘（三角瓶菌液）；温度为30℃—39℃—30℃；湿度为58%左右；

-18-山东农业大学学士学位论文在此条件下发酵5天，能够获得较高的孢子产量。该固体发酵生产黑曲霉，与液体相比具有制作简单，成本低廉，孢子含量高，易于保存和运输等优点。对黑曲霉的工厂化生产具有重要的指导意义。

有机物料腐熟剂的有效活菌的数量是判断腐熟剂合格与否的重要指标。通过对济宁三环化工生产的有机物料腐熟剂进行检测并与GB20287-2006农用微生物菌剂标准相对比，确保了腐熟剂产品的质量。在市场经济日益发达的今天，质量对于一个企业的重要性越来越强，产品质量的高低是企业有没有核心竞争力的体现之一，保证产品质量就是保证企业占有市场，从而能够持续经营的重要手段，一个企业想做大做强，在增强创新能力的基础上，努力提高产品和服务的质量水平是重要的辅助手段。

参考文献[1]张锦亮，固体发酵技术应用的研究进展，重庆科技学院学报2005,7(1):121-124.[2]吴雪梅，小曲中霉菌的分离纯化鉴定，酿酒科技，2004,6:247-248.[3]杨全，李艳辉，等，药用真菌桑黄液体发酵工艺的研究,中国酿造，

2004(5):137-138.

[4]王丽丽，黑曲霉固态发酵产生果胶酶条件的优化，食品科技，2008(5):14－18.[5]庄桂，发酵麸皮制取红曲色素的初步研究，中国酿造，2007(4):126-128.[6]李永泉，赵小立，等，复合水解酶黑曲霉HD-1固体发酵工艺研究，真菌学报，

1995,14(3):226-233.

[7]李卫华，武新民，等，黑曲霉产酶条件的研究，检验检疫科学,2000,10(3):[8]张怀，袁其朋，等，木聚糖酶生产菌黑曲霉的诱变及周期变压发酵，北京化工

大学学报，2001,28(1):

[9]王景林，刘晓明，等，纤维素酶产生菌黑曲霉X-15的选育及其产酶条件，中

国兽医学报，2000,20(1):

[10]刘时轮，李勇，等，绿色木霉菌株Tv04-02固体发酵条件研究，华北农学报，2008,23:244-247.

[11]李亚兰，张建新，等，微生物肥料中有效活菌数检测方法，西北农业学报，1999,8(4):94-96.

[12]中华人民共和国国家标准，GB20287-2006,2006-05-25

-19-黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测致谢本论文是在济宁三环化工有限公司技术中心完成的。

实习期间，导师杜志兵工程师和丁延芹教授在学习和生活中都给了我极大的关心与帮助。在此，谨向导师表示衷心的感谢和崇高的敬意。特别感谢魏咏梅老师和刘宝老师给予我的热心辅导和无私帮助。谨向所有关心和帮助过我的老师和同学致以深深的谢意。

刘强2010年6月

-20-