考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量

【实验目的】

1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。 2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。 【实验原理】

1976年Bradford等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm变为595 nm，光吸收增加。蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

OCH2CH3NHCH3CH3H++蛋白质+ CH3CH2NNCH2CH3蛋白质-染料复合物（蓝色，λmaxCH2CH2595nm）SO3-SO3Na考马斯亮蓝G-250

【仪器与试剂】

1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。

2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。 【实验步骤】

1．标准蛋白质溶液的配制

称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml的溶液。 2．蛋白试剂的配制

称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。

3．标准曲线的制作

取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 l于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。

4．样品测定

取含10~100 g蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。根据吸光度值计算样品中蛋白质的含量。 【实验结果】

1．绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

蛋白质重量（mg） 体积（l） CS（mg/ml） A 回归方程和相关系数 5 10 20 50 100 2．计算蛋白质的含量。

Wx（mg） A Cx（mg/ml） 蛋白质含量（%） RSD（%） 【注意事项】 1．牛血清白蛋白预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度确定称取量，或根据牛血清白蛋白的紫外吸光系数为6.6来确定。

2．一些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4和乙醇等物质不干扰测定，而大量的去污剂如Triton X-100和SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用

适当的对照而消除。

3．如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20分钟内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的；比色反应需在1小时内完成。

4．测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的；测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

实验二 3、5-二硝基水杨酸比色法测定糖的含量

【实验目的】

1．掌握3、5-二硝基水杨酸比色法测定糖含量的原理和过程。 2．了解糖含量测定的干扰因素。 【实验原理】

还原糖是指含自由醛基或酮基的单糖（如葡萄糖）和某些具有还原性的双糖（如麦芽糖）。 它们在碱性条件下，可变成非常活泼的烯二醇。遇氧化剂时，具有还原能力，烯二醇本身则被氧化成糖酸及其他产物。黄色的3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂与还原糖在碱性条件下共热后，自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，反应液里棕红色物质颜色深浅程度与还原糖的含量成一定比例关系，在波长为520nm处测定溶液的吸光度，查对标准曲线并计算，便可求得样品中还原糖的含量。

对于非还原性的双糖（如蔗糖）以及还原性很小的多糖（如淀粉），应先用酸水解法将它们彻底水解成单糖。再借助于测定还原糖的方法，可推算出总糖的含量。由于多糖水解时，在每个单糖残基上加了一分子水，因而在计算时，须扣除加入的水量，当样品里多糖含量远大于单糖含量时，则比色测定所得总糖含量应乘以折算系数（1 - 18/180 = 0.9），即得比较接近实际的样品中总糖含量。

【仪器与试剂】

1．紫外-可见分光光度计，恒温水浴。

2．3、5-二硝基水杨酸试剂，6mol/L盐酸，10%氢氧化钠，酚酞指示剂，碘-碘化钾溶液。

3．无水葡萄糖（AR），山芋粉。 【实验步骤】

1．葡萄糖标准液的配制

精密称取预先在105C干燥至恒重的无水葡萄糖100 mg，用少量蒸馏水溶解后，定量转移至100 ml容量瓶中，再加水定容至刻度，摇匀，即得浓度为l.0 mg/ml的标准溶液。

2．总糖样品液的制备

精密称取1 g山芋粉，置锥形瓶中，加入6 mol/L盐酸液l0 ml和水15 ml，在沸水浴中加热0.5小时，取出1～2滴置于白瓷板上，加l滴碘-碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈蓝色。冷却后加入l滴酚酞指示剂，以10%氢氧化钠溶液中和至溶液呈微红色，过滤，滤液加水定容至100 ml。再精确吸取上述溶液l0 ml于100ml容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用。

3．还原糖样品液的制备

精密称取2 g山芋粉，置100 ml烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50～60ml蒸馏水，于50C恒温水浴中保温20分钟，过滤，将滤液收集在100 ml容量瓶中，加水定容至100 ml。

4．标准曲线的制作

取5支试管，分别加入0.1、0.2、0.5、1.0和2.0 ml葡萄糖标准液，加水至2.0 ml后，再加入3、5-二硝基水杨酸试剂1.5 ml；混合均匀，在沸水浴中加热5分钟；取出后立即用冷水冷却至室温。再向每管加入21.5 ml蒸馏水，摇匀；用2.0 ml水作为空白，于520 nm波长处测吸光度（A）值。以葡萄糖质量（mg）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标绘制标准曲线。

5．样品中总糖和还原糖的含量测定

分别取1.0 ml总糖样品液或还原糖样品液，加入蒸馏水1.0 ml和3、5-二硝基水杨酸试剂1.5 ml，其余操作均与标准曲线的制作相同。以2.0 ml蒸馏水作空白对照，平行测定3份样品液。测定后，根据样品的吸光度平均值在标准曲线上

查出相应的糖量，用下式计算出山芋粉中还原糖与总糖的百分含量。

Cx×D还原糖含量（%）= ×100%Wx Cx′×D总糖含量（%）= ×100%Wx

式中，CX和CX′分别为样品水解前和水解后的还原糖浓度，D为样品溶液的稀释体积，WX为样品称取量。 【实验结果】

1．绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数。

葡萄糖重量（mg） 体积（ml） CS（mg/ml） A 回归方程和相关系数 0.1 0.2 0.5 1.0 2.0 2．计算还原糖和总糖的含量。

还原糖含量测定结果

WX（mg） A CX（mg/ml） 还原糖含量（%） RSD（%） 总糖含量测定结果

WX′（mg） A CX′（mg/ml） 总糖含量（%） RSD（%）