脂肪酶产生细菌的筛选
巩素绢
（河北农业大学生命科学学院微生物与生化药学，河北保定071001）
摘要：从富含油脂的土壤中寻找高产脂肪酶的真菌，以期为扩大脂肪酶的菌源提供材料。本试验从保定市炼油厂附近土样中，经富集培养、平板筛选得到22株脂肪酶产生菌株，通过复筛得到1株脂肪酶活力较高真菌。为脂肪酶产生菌以及脂肪酶的工业化生产与应用奠定了基础。关键词：脂肪酶；筛选；真菌Abstract：Thestudyaimedtoseekforthefungiwithhighyieldoflipasefromthegreasysoil，soastoprovidethematerialforexpandingthefungisourceoflipase.22strainsoffungiproducinglipasewereisolatedbyenrichmentcultureandflatscreeningmethodsinsoilsamplescollectedfromtherefineryofBaoding．Astainwithhigheractivityofproducinglipasewasisolatedbyre-screeningmethods.Thestudylaidafoundationforlipaseproducingbacteriaandindustrialproductionandapplicationoflipasetosomeextent．Keywords:Lipase;Screening;fungi前言
脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3，甘油三酯水解酶)，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸［1］。微生物脂肪酶比动物脂肪酶酶解作用的pH和温度范围更宽，便于工业化生产获得高纯度酶制剂［2］。脂肪酶在微生物界分布很广，据不完全统计，目前已有65个属的微生物能够产生脂肪酶［3］。随着对微生物脂肪酶研究的深入，已发现多种具有不同的酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景［4］。
就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已进行了多年研究，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难和应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多［5］。国内，脂肪酶的研究与开发曾被连续列为3个“五年”攻关项目，但目前对脂肪酶制剂的需求仍主要依赖进口［6］。因此，该研究拟通过初筛和复筛从富含油脂的土壤中寻找高产脂肪酶的真菌，以期为扩大脂肪酶的菌源提供材料。
1材料与方法
1.1样品1.1.1供试土样
8个土样分别采自保定市周边植物油厂、餐厅、菜市场、屠宰场等周围富含油脂的土壤。1.1.2试剂
聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）购自天津市化学试剂三厂；橄榄油购自上海医药（集团）上海化学试剂公司；其他生化试剂或化学试剂均为进口或国产分析纯。1.1.3培养基
富集培养基：每升含0.5g(NH4)2SO4，0.1gNH4NO3，0.1gNaCl，0.1gMgSO4·7H2O，0.5gK2HPO4，0.1gFeSO4·7H2O，10mL橄榄油，用0.1mol/LNaOH调pH8.0。
初筛培养基：每升含0.5g(NH4)2SO4，0.1gNH4NO3，0.1gNaCl，0.1gMgSO4·7H2O，0.5gK2HPO4，0.1gFeSO4·7H2O，20g琼脂，121℃灭菌20min后，于60℃左右加含0.2%溴甲酚紫的聚乙烯醇橄榄油乳化液12mL。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。
PDA培养基：马铃薯200.0g/L，蔗糖20.0g/L，琼脂20.0g/L。PDB培养基不添加琼脂。
发酵培养基：每升含1.0g(NH4)2SO4，1.0gMgSO4·7H2O，1.0gNaH2PO4，2.0gK2HPO4，10mL橄榄油，20g黄豆粉，10g蔗糖。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。
种子培养基：每升含5.0g(NH4)2SO4，1.0gK2HPO4，0.5gMgSO4·7H2O，20g葡萄糖，25g蛋白胨，10mL橄榄油。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。1.2试验方法
1.2.1产脂肪酶菌株的筛选1.2.1.1富集培养
将采集的土样10g溶于90mL蒸馏水中，充分摇匀，取上清液2mL加入到含20mL富集培养基的l00mL三角瓶中，30℃、200r/min振荡培养2d。再次取1mL富集培养液转接到新的20mL富集培养基中，进行第2次富
集。共富集3次。1.2.1.2平板分离
将第3次富集培养液采用梯度稀释法稀释后涂布于筛选培养基上，30℃恒温培养72h，紫外灯下观察所长菌落周围有无荧光圈及荧光圈大小，荧光圈直径/菌落直径(HC值)愈大，表示该菌株产脂肪酶能力愈强。每个梯度作3个平行。将HC值较大的菌株用划线分离纯化，纯化后接种于PDA斜面4℃保藏。1.2.1.3菌株复筛
无菌条件下将筛选菌株接种于发酵培养基上，30℃振荡培养48h。发酵液6000r/min离心，上清液即为粗酶液。利用平板扩散法测定粗酶液酶活，比较酶活力的大小，最终获得产酶能力较高的菌株，并斜面保存。1.2.1.4平板扩散法测定脂肪酶酶活
配制溴甲酚紫显色培养基并倒平板。冷却凝固后，利用无菌打孔器在平板上打孔，孔径0．8cm。取粗酶液0．1mL注入孔中。每个显色平板作2个平行。将平板置于30℃条件下反应12h后观察变色圈大小，判断粗酶液的酶活大小。
2结果与分析
2．1脂肪酶产生菌株的筛选2．1．1选择平板初筛
用溴甲酚紫平板对土样进行初筛，获得22株产脂肪酶菌株(表1)，发现5、7、16和18号菌株HC值≥1．5，产酶能力较高，因此对这4株菌株进行复筛。
表1菌株初筛、复筛结果Table1Screeningandrescreeningresultsofstrains序号No．12345初筛Screening1.21.31.31.21.71.6HC值HCvalue复筛Rescreening67101112131415161718192021221.41.61.31.21.31.41.31.11.41.41.51.31.51.41.31.21.41.21.41.52．1．2平板扩散法复筛
挑取初筛的4株菌株，接种于发酵培养基中，30℃振荡培养48h后，离心得粗酶液，利用平板扩散法测定酶活大小，结果见表1。可以看出，初筛的4株菌株产脂肪酶能力依次为5号＞7号＞16号＞18号，因此确定5号菌株为目的菌株。
3结论
从富含油脂土壤中分离得到1株产脂肪酶能力较高的菌株，根据菌落及个体形态，查阅相关鉴定手册，初步确定该菌株为黑曲霉。
参考文献
［1］胡长浩,施文芳,沈麟,等.脂肪酶菌种的筛选,鉴定及酶学性质研究［J］.生物技术,2009,19(2):53-57.［2］董明奇,史岩,姜春雷,等.脂肪酶高产菌株的筛选及酶学特性研究［J］.四川大学学报,2008,45(4):985-990.［3］JAEGERK,EGGERTT.LipasesforBiotechnology［J］.CurrentOpinioninBiotechnology,2002,13(4):390-397.［4］周海霞,袁丽红,欧阳平凯.脂肪酶假单胞菌的分离培养及最佳产酶条件研究［J］.现代生物医学进展,2008,8(2):259-262.［5］孙宏丹,孟秀香,贾莉,等.微生物脂肪酶及其相关研究进展［J］.大连医科大学学报,2001,23(4):292-295.［6］张巧艳,钱俊青.响应面法优化黄杆菌突变株产脂肪酶摇瓶发酵条件［J］.浙江工业大学学报,2009,37(2):156-160.